Localización de emisores individuales con haces dona: qué se hizo, qué se resolvió y cómo seguir hacia p-MINFLUX

2.1 ¿Qué modelo de dona usar?

Cómo

Implementamos la dona vectorial (máscara de vórtice y polarización circular) y la comparamos con la LG, en la forma cerca del cero y en el CRB resultante.

Resultado

Una LG con la misma curvatura en el cero reproduce el CRB vectorial (diferencia < 0.4 %), así que el modelo LG alcanza. Si la polarización tiene la handedness opuesta, el cero se llena hasta el 85 % del pico y el CRB crece unas 90 veces. [src:vectorial]

Queda

Aberraciones reales (origen físico de un cero imperfecto). El diámetro de la dona frente a PyFocus con filling factor 1 no coincide (428 frente a 401 nm).

2.2 ¿Cuál es la precisión límite, y qué pasa en el centro del patrón?

Cómo

Calculamos la información de Fisher numéricamente en todo el campo y derivamos formas cerradas para el centro.

Resultado

Sin fondo, el CRB es discontinuo en el centro. El límite r→0 vale 1.61 y el valor puntual de Balzarotti (Eq. S27), 1.80 (L = 50, N = 100). La razón es 0.890, cercana a 2/√5, que es el valor exacto para un cero cuadrático. Con fondo la discontinuidad desaparece. El CRB escala como σ ∝ L^1.00N^−0.50 para L ≪ fwhm. Bastan 13 fotones para 5 nm, cuando una cámara ideal necesita 400. [src:crb_center] [src:scaling]

2.3 ¿Qué estimador alcanza ese límite?

Cómo

Monte Carlo del MLE frente a los estimadores lineales LMS y mLMS, dentro y fuera del TCP.

Resultado

Con fondo, el MLE es eficiente: eficiencia 0.991 con SBR = 10. LMS y mLMS se sesgan lejos del centro: −14.4 y −5.2 nm a 25 nm, contra 0.7 del MLE. Sin fondo el modelo no es regular en el centro, y el MLE queda por debajo del límite (0.84 del CRB) pero sesgado hacia el centro. [src:estimators]

Queda

Confirmar la convención SBR = 10 que se usa para medir la eficiencia.

2.4 El cero real no es perfecto: ¿conviene achicar L?

Cómo

Barrido del CRB en función de L para distintos ceros residuales ε = I(0)/I_max.

Resultado

No siempre: hay un L óptimo ≈ 0.78·fwhm·√ε para ε ≲ 0.01. Vale 10.5, 23 y 50 nm para ε = 0.002, 0.01 y 0.05. Es el criterio para elegir el L fijo. [src:zero_depth]

Queda

Optimizar L con ε y fondo juntos, usando valores medidos.

2.5 Las donas no están donde se cree

Cómo

Perturbamos al azar las posiciones de las donas (δ) y estimamos con el patrón nominal y con el verdadero.

Resultado

Con el patrón nominal, el sesgo en el centro es ≈ 0.78·δ: 7.7 nm con δ = 10. Con el patrón verdadero baja a 0.18 nm, así que la solución es calibrar. Para un sesgo menor que 1 nm hace falta δ ≲ 1.3 nm (1/0.78). [src:misalignment]

Queda

Simular cómo se mide el patrón y con qué error.

2.6 Fondo mal modelado nuevo

Cómo

SimuFLUX muestra que ignorar el fondo sesga fuertemente el estimador (su Fig. 2d). Hicimos el análogo para TCP fijo con MLE: fondo igual en las 4 ventanas, N = 500, y cuatro variantes del estimador (sin fondo, fondo exacto, fondo libre, fondo con error de ±30 %). Código en background.py.

Resultado

Si el MLE ignora el fondo, lee la señal extra de la exposición central como un emisor más alejado y sesga la posición hacia afuera: ≈ +5 nm en x y +3 nm en y con SBR = 5, y ≈ +2 nm con SBR = 20. Ajustar el fondo como tercer parámetro elimina el sesgo y cuesta poco: el CRB sube 0–4 % hasta 20 nm del centro y 20–26 % en r = L/2. Un error de ±30 % en el fondo deja ≤ 1.6 nm (Fig. 3). [src:background]

Queda

Fondo distinto en cada ventana y cómo medirlo en los datos.

2.7 Parpadeo del fluoróforo nuevo

Cómo

SimuFLUX muestra que en MINFLUX secuencial el parpadeo suma un error σ_fl que no depende del número de fotones. Simulamos un parpadeo on/off de 100 µs durante 400 µs, con exposiciones en bloques (secuencial) o alternadas cada 12.5 ns (p-MINFLUX). Código en pminflux.py.

Resultado

En el modo secuencial, σ_fl va de 16 nm (1 pasada del patrón) a 2.2 nm (25 pasadas), y se cumple STD² = σ_fl² + σ², como en SimuFLUX. Con el entrelazado, las 4 exposiciones ven el mismo tiempo "on" y σ_fl ≲ 0.03 nm. Es una ventaja concreta de p-MINFLUX (Fig. 2a). [src:pminflux_flicker]

Queda

Parpadeo rápido (de ns a µs) y fotoblanqueo: el entrelazado protege solo si el parpadeo es mucho más lento que 50 ns.

2.8 Cruce entre ventanas por el tiempo de vida nuevo

Cómo

Este efecto es propio de la excitación pulsada y SimuFLUX no lo trata. Un fotón excitado por un pulso llega con retardo exponencial de tiempo de vida τ y puede caer en la ventana siguiente. Derivamos la matriz de mezcla p^obs = M p, con M_ij = (1−q)q^{(s_i−s_j) mod 4}/(1−q⁴) y q = e^−T/τ, y la validamos con Monte Carlo de fotones.

Resultado

Con τ = 5 ns, un 7.5 % de los fotones cae en la ventana siguiente. Si el estimador ignora M, el sesgo es de 3.4 nm (τ = 3 ns) y de 8–13 nm (τ = 5 ns, según el orden de los pulsos). Si incluye M, el sesgo desaparece y el CRB sube 4–19 % (τ = 3–5 ns) (Fig. 2b–c). M depende solo de τ y T, así que corregirlo no cuesta nada. [src:pminflux_crosstalk]

Queda

Todo lo anterior supone ventanas alineadas con el pulso y sin respuesta del instrumento (IRF). El simulador de §3 ya generaliza M a IRF y ventanas arbitrarias; falta contrastarla con el histograma TCSPC medido.

2.9 Problemas del propio proceso

Cómo

Cada número del manuscrito es una macro que resuelve contra data/paper_numbers.json, y un script (check_provenance.py) rechaza cualquier número sin procedencia. Las figuras y los JSON se regeneran byte a byte.

Resultado

Los verificadores refutaron afirmaciones en varias rondas, y se corrigieron antes de entrar al texto. En este informe, por ejemplo, el rango de σ/CRB con fondo exacto (0.97–1.06) y un artefacto de malla en el cruce entre ventanas para τ = 1 ns. Un test fallaba con numpy 2 y se arregló. MINFLUX iterativo se estudió (0.51 nm con 1000 fotones, frente a 3.16 nm de una cámara ideal), pero no aplica a p-MINFLUX con L fijo.

Queda

Los estudios nuevos (§2.6–2.8) todavía no están en el manuscrito ni en reproduce.py. Los tests nuevos no se corrieron en el entorno de referencia (Windows, Python 3.8).

Qué se revisó

El simulador anterior, en 16 hallazgos con un script que demuestra cada uno. Uno es conceptual: el modelo de probabilidades suponía fondo 1/K por ventana y ningún cruce entre pulsos, lo que no vale para ventanas más cortas que T/K ni con tiempo de vida finito. Nueve son de implementación: el TCSPC se quedaba con el fotón equivocado cuando llegaban varios en un ciclo, las ventanas no se plegaban módulo el período, el parpadeo se ignoraba en silencio, el emisor y el MLE quedaban atados a la grilla de la PSF, SBR infinito daba NaN, entre otros. Seis son de diseño; el más importante es que los estudios apagaban el tiempo de vida (τ ≈ 0), de modo que no podían ver el error del modelo.

Mejoras

Simulador fotón a fotón en tiempo absoluto, con tiempo de vida, IRF, ventanas arbitrarias, TCSPC de un fotón por ciclo, tiempo muerto del detector, fondo y parpadeo. Matriz de mezcla C (el M de §2.8, generalizada) con IRF y comienzos de ventana arbitrarios. MLE continuo, sin grilla, cuya verosimilitud coincide con ese modelo directo, con fondo libre opcional. CRB con cruce y parámetros de molestia. Todo con 75 tests y procedencia (semilla y hash del código en cada resultado).

Resultados

La matriz de mezcla reproduce las fracciones por ventana del simulador anterior (χ² = 5.7, p = 0.13), mientras que el modelo sin cruce queda descartado (χ² = 1927). En datos simulados con cruce realista, el estimador anterior tiene un sesgo de hasta 3.1 nm y RMSE/CRB = 1.67; el nuevo, 0.12 nm y 1.00. Con el patrón desalineado, el estimador ingenuo llega a 8.6 nm y el nuevo queda en 0.09 nm. Un resultado analítico verificado: si el tiempo muerto es un múltiplo entero del período (d = n·T), no sesga las fracciones por ventana a ninguna tasa. [src:pminflux_simulations]

Queda

Validar el modelo directo con datos reales (histograma TCSPC y cruce medido); medir el tiempo muerto y la IRF, que hoy son supuestos; rehacer los estudios con PSF medidas; incluir la distorsión de tasa finita, que hoy aporta ≤ 0.03 CRB; calibrar aparte las potencias de los haces, porque estimarlas junto con la posición introduce un sesgo que no baja con más datos.